L'EPFL riduce a un solo scatto quello che finora richiedeva decine di migliaia di fotogrammi. Il gruppo di Aleksandra Radenovic ha pubblicato su Nature Methods una tecnica di microscopia a fluorescenza che ricava un'immagine oltre il limite di diffrazione da una singola esposizione della telecamera, con un guadagno di risoluzione di almeno 1,7 volte rispetto al campo largo di partenza.
Un fotogramma al posto di migliaia
La tecnica si chiama SPIFFI, sigla di spatial polarization-induced fluorescence fluctuation imaging. I metodi a super-risoluzione a campo largo già in uso pagano la nitidezza con il tempo: la microscopia di localizzazione di singola molecola chiede decine di migliaia di fotogrammi e resta di fatto confinata ai campioni fissati, mentre la SOFI ne pretende centinaia quando il segnale fluttua poco. La cellula viva, però, non aspetta: si muove, si divide, cambia forma durante la finestra di acquisizione, e il risultato è un'immagine impastata da artefatti da movimento.
Con SPIFFI la sequenza si comprime a uno scatto, e il salto è di quattro ordini di grandezza sui tempi tipici della localizzazione di singola molecola. La conseguenza pratica è che ogni fotogramma acquisito è già super-risolto: la sequenza diventa un filmato in super-risoluzione, non una singola immagine ricostruita a posteriori.
La polarizzazione al posto del tempo
Quasi tutti i coloranti usati in biologia emettono da stati dipolari, e la luce che ne esce oscilla in direzioni preferenziali a seconda di come la molecola è orientata. SPIFFI divide l'emissione in quattro canali sensibili a polarizzazioni lineari diverse e mette a confronto le quattro sottoimmagini nello stesso istante, invece di confrontare un fotogramma con quelli che lo precedono. Sotto rivelazione polarizzata la macchia in cui l'ottica sparpaglia un punto luminoso, la PSF, ha un profilo più stretto di quella isotropa assunta nella microscopia convenzionale, e resta più stretta qualunque sia l'orientamento del dipolo.
La ricostruzione parte da lì. Un algoritmo rolling ball rimuove il fondo fuori fuoco, la deconvoluzione e l'autocorrelazione chiudono il lavoro, e la risoluzione finale si ferma intorno ai 160-170 nanometri sul singolo fotogramma. Un secondo passaggio che ripassa l'immagine con i metodi basati sulle fluttuazioni già in uso scende a circa 80 nanometri, senza introdurre artefatti rilevabili. Sopra a tutto questo, l'intensità relativa dei quattro canali restituisce anche l'orientamento del dipolo fluorescente e la sua anisotropia: informazione a sei dimensioni contro le due o tre della fotografia tradizionale al microscopio.
Perché il costo di adozione è vicino a zero
Il dato che i laboratori italiani leggeranno per primo è un altro. L'hardware ottico di SPIFFI si monta sui microscopi a fluorescenza già installati: nessun apparato costruito attorno alla tecnica, nessuna curva di apprendimento su una piattaforma nuova. La stessa logica di innesto vale sulla parte software, dove il Laboratory of Nanoscale Biology dell'EPFL ha già dimostrato l'integrazione con i pacchetti di elaborazione delle fluttuazioni oggi in uso. Per il tessuto della ricerca biomedica pubblica, con budget di rinnovo strumentale contenuti, è la differenza fra una tecnologia disponibile subito e una tecnologia rimandata alla prossima gara.
La direzione di marcia è la stessa che negli ultimi anni ha portato in laboratorio strumenti prima considerati fuori portata: dalle sonde HoTs che scendono a 3 nanometri sul ripiegamento del DNA fino allo spettrometro FLEX di Leonardo che legge una luce debolissima. Ogni salto tecnico che si innesta sull'infrastruttura esistente allarga la platea dei gruppi che possono usarlo.
Il gruppo di Losanna sta ora lavorando a una versione più compatta dell'ottica e all'integrazione con le tecniche di imaging tridimensionale. Un laboratorio con un microscopio a campo largo, quattro polarizzatori e un algoritmo di autocorrelazione ha già in casa i mattoni per replicare l'esperimento.
Domande frequenti
Che cos'è la tecnica SPIFFI e in cosa si differenzia dai metodi di super-risoluzione tradizionali?
SPIFFI è una tecnica di microscopia a fluorescenza che permette di ottenere immagini oltre il limite di diffrazione da una singola esposizione, invece di richiedere decine di migliaia di fotogrammi come i metodi tradizionali. Utilizza la polarizzazione della luce per ottenere una maggiore risoluzione in tempi molto più rapidi.
Quali sono i principali vantaggi di SPIFFI rispetto alle tecniche precedenti?
SPIFFI consente di acquisire immagini super-risolte in un solo scatto, riducendo drasticamente i tempi di acquisizione e minimizzando gli artefatti da movimento tipici delle cellule vive. Inoltre, può essere implementata sui microscopi a fluorescenza già esistenti, con costi di adozione molto bassi.
Come funziona tecnicamente SPIFFI per migliorare la risoluzione delle immagini?
SPIFFI divide l'emissione fluorescente in quattro canali polarizzati e confronta le sottoimmagini risultanti nello stesso istante. Un algoritmo specifico rimuove il fondo fuori fuoco e, tramite deconvoluzione e autocorrelazione, permette di raggiungere risoluzioni fino a 160-170 nanometri sul singolo fotogramma, e circa 80 nanometri dopo un secondo passaggio di elaborazione.
È necessario acquistare nuovi strumenti per implementare SPIFFI in laboratorio?
No, l'hardware ottico di SPIFFI si può montare su microscopi a fluorescenza già presenti nei laboratori e il software è compatibile con i pacchetti di elaborazione delle fluttuazioni già in uso. Questo rende la tecnologia immediatamente accessibile senza dover investire in nuove piattaforme costose.
Quali informazioni aggiuntive può fornire SPIFFI rispetto alla microscopia tradizionale?
SPIFFI non solo migliora la risoluzione spaziale, ma restituisce anche informazioni sull'orientamento e l'anisotropia del dipolo fluorescente, offrendo dati a sei dimensioni rispetto alle due o tre della microscopia convenzionale.
